蛋白穩定性分析儀-PSA-16用于開發新型疫苗

蛋白穩定性分析儀PSA-16助力武漢大學病毒學國家重點實驗室科研工作者于2024年8月份在Nature子刊《npj Vaccines》雜志上發表論文“An attachment glycoprotein nanoparticle elicits broadlyneutralizing antibodies and protects againstlethal Nipah virus infection”。本研究以尼帕病毒G蛋白頭部域為抗原靶標，成功開發出一種新型的、安全有效的自組裝蛋白納米顆粒疫苗，該疫苗能夠誘導抑制多種亨尼帕病毒感染的廣譜中和抗體，并對尼帕病毒感染的倉鼠提供保護。

Zhou, D. et al. 

npj Vaccines 9, 158 (2024).

https://doi.org/10.1038/s41541-024-00954-5

蛋白質的熱穩定性是指蛋白質多肽鏈在溫度影響下的形變能力，主要體現在溫度改變時多肽鏈的化學特性和空間構象的變化，變化越小熱穩定性越高。蛋白質的熱穩定性受到不同溫度、pH值、離子強度等外界因素的影響，在生物技術、藥物研發以及食品工業等領域，具有重要意義。

蛋白質變性溫度是生物學家們研究蛋白質的熱穩定性的一個重要的概念，是指蛋白質在特定溫度條件下受到熱力作用時，其結構發生變化的溫度點，一般溫度較高時，蛋白質從穩定的三維結構變化成松散的無序結構。蛋白質的熱穩定性一般使用熱變性中點溫度（Tm）來表示，即蛋白質解折疊50% 時的溫度。

01 前言

尼帕病毒（NiV）是一種負義單鏈RNA病毒，最初是在1998年至1999年馬來西亞和新加坡爆發期間分離和鑒定的。NiV感染可導致嚴重的腦炎和呼吸道疾病，病死率高達75%。另外在幸存者中也觀察到長期神經系統疾病和NiV感染復發。目前，還沒有批準的可用于人類的疫苗或治療方法。NiV編碼一種病毒膜蛋白：糖蛋白（G），G蛋白位于病毒表面，負責受體識別和結合，受體結合后，G蛋白經歷一系列構象變化，完成與靶細胞的膜融合，從而幫助病毒進入靶細胞并引發感染。此外，許多中和和保護性抗體主要針對G蛋白，表明G病毒蛋白是疫苗開發的關鍵抗原。最近已經開發了多種針對NiV感染的疫苗平臺，包括亞基疫苗、mRNAs、病毒樣顆粒（VLP）、病毒載體疫苗和DNA疫苗，但還沒有對自組裝納米粒子平臺進行NiV感染評估。

02 摘要

作者設計了一種基于鐵蛋白的自組裝納米粒子，在表面顯示NiV G頭部結構域（NiV G-鐵蛋白，NiV G-ferritin），并評估了可溶性NiV G頭結構域（NiV sG）或NiV G-鐵蛋白引發的免疫反應，并且通過一系列研究數據表明NiV G鐵蛋白是一種安全有效的尼帕病毒感染候選疫苗。

03 結果

作者借助北京佰司特科技有限責任公司自主研發的蛋白穩定性分析儀PSA-16，通過差示掃描熒光法（Differential scanning fluorimetry，DSF）原理進行NiV G-ferritin和NiV sG的熱穩定性分析，結果表明，NiV G-ferritin和NiV sG表現出相似的熱穩定性，Tm為~65°C，表明NiV G和ferritin的融合對其結構穩定性沒有顯著影響。

04 方法

蛋白穩定性分析儀PSA-16（北京佰司特科技有限責任公司）通過差示掃描熒光法（Differential scanning fluorimetry，DSF）測定靶蛋白的熱穩定性。將樣品稀釋至0.5mg/mL，并將20μL稀釋后的樣品裝入石英玻璃管中。

使用23至97°C的線性溫度掃描，以1°C/min的加熱速度實時動態測量靶蛋白在280nm紫外激發下的330nm和350nm的熒光強度（F）。

根據F350nm/F330nm曲線的斜率計算熱變性中點溫度（thermal transition midpoint，Tm）。每個樣品平行測量四次。

作者也致謝了北京佰司特科技有限責任公司，提供自主研發的蛋白穩定性分析儀PSA-16，獲得蛋白樣品熱穩定性分析的數據。

05 內源差示掃描熒光法（inDSF）

內源差式掃描熒光inDSF，基于蛋白質中特定氨基酸的熒光特性。這些氨基酸的熒光強度與其所處的微環境密切相關，因此，當蛋白質的結構發生變化時，這些氨基酸的熒光信號也會隨之改變。不需要額外的熒光染料加入到檢測體系中，利用蛋白內部芳香族氨基酸的自發光原理。不需要任何額外的標記或固定步驟，避免引入結果的不確定性。

研究發現，蛋白質分子中芳香環氨基酸在處于不同極性的微環境時 (如疏水或親水環境中)，其被激發的內源熒光的最大發射光譜會發生位移。蛋白質中內源熒光主要來自含芳香環氨基酸如色氨酸 (Trp)，苯丙氨酸 (Phe) 和酪氨酸 (Tyr)，其中以色氨酸內源熒光ZUI強。當它在蛋白內部時，發射光主要在330波段，當蛋白一旦去折疊，暴露在溶劑中，發出的光就會從330波長紅移到350。所以通過280激發，檢測330/350的比值變化，就能測量蛋白質的Tm值。

以色氨酸為例，在蛋白質疏水的內核微環境中，其內源熒光最大發射波長在330 nm左右，而在親水的極性微環境中，色氨酸的內源熒光最大發射波長則出現在350 nm左右。蛋白質熱變性或者化學變性通常會導致色氨酸殘基周圍微環境的極性發生變化，使通常被包埋于蛋白質疏水內核的色氨酸逐漸暴露于親水的環境中，從而導致發射內源熒光最大發射波長發生紅移(Red Shift)，即向更大的波長區域 移動。

特點：內源差式掃描熒光DSF無需復雜的樣品處理或標記步驟，實驗相對簡便。但不是所有蛋白質都含有足夠的熒光基團，且可能會受其他基團影響。

06 蛋白穩定性分析儀PSA-16

北京佰司特科技有限責任公司于2023年推出了自主研發的第一款國產的蛋白穩定性分析儀PSA-16。

PSA-16的性能和參數達到進口設備的水平，價格卻遠低于進口產品，彌補了目前國產自主設備在蛋白穩定性研究分析領域的空白。

主要參數★ 測定參數：Tm、Cm、ΔG等；

★ 樣品通量：16個；

★ 樣品體積：≤20 uL；

★ 濃度范圍：0.01-200 mg/ml；

★ 溫控范圍：15-110度；

★ 變溫速度：0.1-15度/分鐘；

★ Tm重復性：CV小于1%；

★ 耗材參數：一次性，無需清洗；

★ 八聯排設計，適配多通道移液器；

多功能蛋白穩定性分析儀PSA-16基于內源差示掃描熒光（ifDSF）技術，廣泛應用于蛋白質穩定性研究、蛋白質類大分子藥物（抗體）優化工程、蛋白質類疾病靶點的藥物小分子篩選和結合力測定等領域，具有快速、準確、高通量等諸多優點。蛋白質中色氨酸/酪氨酸的熒光性質與它們所處的環境息息相關，因此可以通過檢測蛋白內部色氨酸/酪氨酸在加熱或者添加變性劑過程中的熒光變化，測定蛋白質的化學和熱穩定性。

PSA-16采用紫外雙波長檢測技術，可精準測定蛋白質去折疊過程中色氨酸和酪氨酸熒光的變化，獲得蛋白的Tm值和Cm值等數據；測定時無需額外添加染料，不受緩沖液條件的限制且測試的蛋白質樣品濃度范圍非常廣（10 µg/ml - 250 mg/ml），因此可廣泛用于去垢劑環境中的膜蛋白和高濃度抗體制劑的穩定性研究。此外，PSA-16具有非常高的數據采集速度，從而可提供超高分辨率的數據。同時PSA-16一次最多可同時測定16個樣品，通量高；每個樣品僅需要15 uL，樣品用量少，非常適合進行高通量篩選。PSA-16操作簡單，使用后無需清洗，幾乎無維護成本。

多功能蛋白穩定性分析儀PSA-16應用涵蓋植物、生物學、動物科學、動物醫學、微生物學、工業發酵、環境科學、農業基礎、蛋白質工程等多學科領域。蛋白質是最終決定功能的生物分子，其參與和影響著整個生命活動過程。現代分子生物學、環境科學、動醫動科、農業基礎等多種學科研究的很多方向都涉及蛋白質功能研究，以及其下游的各種生物物理、生物化學方法分析，提供穩定的蛋白質樣品是所有蛋白質研究的先決條件。因此多功能蛋白質穩定性分析系統在各學科的研究中都有基礎性意義。

1.    抗體或疫苗制劑、酶制劑的高通量篩選

2.    抗體或疫苗、酶制劑的化學穩定性、長期穩定性評估、等溫穩定性研究等

3.    生物仿制藥相似性研究（Biosimilar Evaluation）

4.    抗體偶聯藥物（ADC）研究

5.    多結構域去折疊特性研究

6.    物理和化學條件強制降解研究

7.    蛋白質變復性研究（復性能力、復性動力學等）

8.    膜蛋白去垢劑篩選，膜蛋白結合配體篩選（Thermal Shift Assay）

9.    基于靶標的高通量小分子藥物篩選（Thermal Shift Assay）

10.    蛋白純化條件快速優化等